واکنش زنجیر های پلیمراز یکی از قدرتمندترین روشها در زیست شناسی مولکولی است. درPCR توالی های اختصاصـی از DNA الگـو یـا cDNA بـا اسـتفاده از الیگونوکلئوتیدهـای آغازگـر اختصاصی و آنزیم DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت، طی چرخ ه های دمایی متوالی هزار تا یک میلیون برابر تکثیر می شوند. اساس واکنش معمولی است با این تفاوت که در آن جمع آوری داده همزمان با انجام PCR زنجیر ه ای پلیمراز هم زمان مشابه PCR معمولی است . با ایـن تفاوت کـه در آن جمع آوری داده همزمـان با انجام واکنـش صـورت میپذیـرد. بنابراین، در این روش، تکثیر و شناسایی در یک مرحله انجام می شود . Real-time PCR شامل یک سری از چرخ ههای دمایی است که حداقل تا حدود 30 چرخه تکرار می شود. هر چرخه شـامل مرحلـه دناتوراسـیون DNA( دو رشـته DNA از یکدیگر باز می شوند)، اتصال توالی های آغازگر به توالی هدف و حساسیت آن به توانایی تکثیر آنزیم وابسته است.
آنالیـز محصوالت در PCR معمولـی در انتهای واکنـش و بـا اسـتفاده از ژل الکتروفورز انجام می شـود. در حالـی که در PCR time-Real مقـدار محصول بعد از هرچرخـه بـا مشـاهده تغییـر در شـدت نور حاصل از ماده فلورسـنت مورد اسـتفاده در ایـن واکنش، قابل ارزیابی اسـت.بنابرایـن، کاربـر دسـتگاه بـا بررسـی واکنـش در ابتدای فـاز نمایـی میتواند مقـدار اولیه مـاده ژنتیکی مـورد آنالیز را بـا دقت بسـیار زیاد تعییـن کند .منحنی تکثیر PCR time-Real به صورت سیگموئیدی بوده که از 4 قسمت تشکیل شده است: فاز پایه،ابتدای
فاز نمایی، فاز نمایی و فاز مسطح یا پلاتو. در طول فاز پایه (معمولا 10 تا 15 چرخه اول) فقط واکنش PCR آغاز شده و انتشار نور فلورسنت در هر چرخه بالاتر از شدت فلورسنت زمینه نیست. در طی فاز نمایی در صورتی که کارایی واکنش 100 درصد باشد، میزان محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر شده و به صورت نمایی افزایش می یابد.
یعنی به ازای n چرخه، n2 کپی DNA تولید میشود؛ بنابراین، در هر چرخه تعداد مولکول DNA هدف 2 برابر میشود . در فاز مسطح، اجزای واکنش مصرف شده و به اتمام میرسد و دیگر محصولی تکثیر نمی شود؛ بنابراین، دیگر افزایشی در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود و به اصطلاح time-Real در این مرحله اشباع شده است (شکل )1
اندازه گیری های کمی براساس آنالیز سیگنال فلورسنت در ابتدای فاز نمایی انجام میشود، نقطه ای که شدت فلورسنت بالاتر از شدت فلورسنت زمینه بوده و نماینده تعداد کپی اولیه در نمونه است آستانه چرخه یا نقطه عبور نامیده میشود.
شکل 1 .منحنی تکثیر واکنش زنجیره ای پلیمراز ه مزمان و فازهای مختلف آن. محور Y ،اختلاف
نشر فلورسنت محصول از نشر فلورسنت پایه را در هر نقطه زمانی نشان می دهد.